神经干细胞与学习和记忆－－从journal club说起

一.神经干细胞
我对成年生物大脑内的新神经元生成－－adult neurogenesis一直很有兴趣。正好看到有人提这篇文章，我就把我的理解说说，来个journal club。欢迎专家使劲砸。

Nature Neuroscience - 10, 355 - 362 (2007)
Published online: 4 February 2007;
Preferential incorporation of adult-generated granule cells into spatial memory networks in the dentate gyrus Nohjin Kee, Cátia M Teixeira, Afra H Wang & Paul W Frankland


文章的介绍提到，以前发现成年动物，比如小鼠和人，大脑的海马里可以不断的产生新神经元。成年大脑可以不断产生新神经元的部分有三个，海马的dentate gyrus, 嗅球，和SubVentrivular Zone，SVZ在大脑皮层下面，这个区域也是在大脑发育早期，整个大脑皮层兴奋性神经元的发源地。
发现了成年大脑可以产生新神经元后，大家都很兴奋，看来大脑修复有望。然后接着有人发现，锻炼身体，给动物一个新的环境，更多一些的玩具，以及种种其他的刺激可以促进产生新的神经元，但是请注意，这里矛盾很多，并没有大家都接受的结论。除了自然过程之外，疾病治疗中使用的某些强力刺激，比如治疗癫痫的
强力电击，也可以促进新神经元产生，这些背景就不多说了，有兴趣者可以看看一篇science上的小文章，Is more neurogenesis always better?
www.sciencemag.org/cgi/content/full/315/5810/336


先说说神经干细胞研究的技术难题，你如何跟踪新生成的神经元？这里推荐大家看Fred Gage实验室几年前的一篇文章，2002 Nature, functional neurogenesis，非常令人赞叹, 他们设计了一种逆转录病毒携带GFP的标记技术，仅仅标记发生过细胞分裂的神经元， 原理是，只有在细胞分裂的时候，细胞核会解开，那么逆转录病毒载体上的GFP就能得以表达，然后你看到的绿色神经元，就是发生过细胞分裂的，那么就是新
生成的神经元喽。在那之前，所有的标记新神经元的方法都是用BrdU来标记复制中的DNA，优点是只染细胞核，在细胞体如蜘蛛网一样密集的大脑里只染细 胞核，NICE！缺点是必需固定组织后才能看到，那么就无法观察活的新生成神经元。02年他们把这个做出来以后，就可以在活体动物大脑切片中，用电极插
在绿色神经元上，观察新生成神经元的种种电学性质。这种方法仍然有一定的缺点，因为需要体外培养细胞先把病毒做出来，然后用成熟的病毒颗粒打到大脑里去，新神经元被标记需要等24h或更久，这样带来一定的创伤性，如果之后要做高等认知功能的测试的话，可能会有问题。


回到这篇文章上来，这篇文章究竟想研究什么问题呢？


在成体神经干细胞研究领域有一个圣餐杯，Holy Grail. 这个问题是整个神经干细胞研究的核心，说它存在吧，每个人都认为它存在，但是谁都不能 证明它确实存在，只是相信，它应该存在，真象传说中的圣餐杯一样。

二.圣餐杯 上


这个圣餐杯就是，成体大脑内的新神经元生成过程究竟有什么用？比如说生理状态下的新神经元生成是否对高等认知功能，例如学习和记忆有贡献？这也是这篇文 章进行研究的问题。


最简单直接，也是最令人信服的方法是Loss Of Function, 将新神经元生成过程阻断，然后观察对成体动物的高等认知功能有无影响。
已有的证据是，这篇文章的前言提到，很久以前，有人用放射线以及一些影响细胞分裂的药物对大脑照了照和加了加，（我们知道放射性可以杀死分裂中的细胞， 比如肿瘤细胞），然后去作学习记忆测试，发现受影响啦。
第一，这些手段损伤性极大，谁知道损伤了什么其他地方的神经元，而且可能并不能非常完全的阻断成体内的新神经元生成。
第二，他们发现的影响都是一些跟学习记忆无关的功能，比如是一些基本的条件反射，这些条件反射不是由学习记忆的高级中枢海马控制的。
那么究竟怎么来用LOF的方法来研究神经元在成体生成究竟对学习记忆由什么影响呢？
唉，非常遗憾的告诉大家，目前还没有方法，谁能做出令人信服的数据，恭喜你，你将于Fred Gage在某年月日一起分享诺贝尔炸药奖。
我在文章最后会说一说我的ideas, 这里按下不表。


那么这篇文章究竟说了什么呢？说白了就一句话，虽然不知道没有新神经元生成对学习记忆有什么影响，但是发现了，在学习记忆之后，新生成的神经元可以"优 先的"加入到已有的海马区记忆神经元网络中去。好，就这么一句话，我们看看他们怎么证明这个观点。


他们这个研究全是在小鼠的海马区的dentate gyrus里做的，就是三个在成体里还能产生新神经元的地方之一。


首先是标记新生成神经元的方法，他们用了最传统的BrdU，来标记复制的DNA，然后在实验后对小鼠进行解剖后免疫组化，寻找BrdU阳性的细胞。


其次，高等认知的任务，他们用水迷宫，简单的说，头天把老鼠扔到水池子里去，水池子的四周有不同的标记物，让老鼠能看见，然后水池子里，放一个平台，刚 刚没入水面以下，让老鼠看不见，但是站在平台上可以免受水淹之苦。老鼠刚被扔进去惊慌失措，发疯似的到处游，突然，碰到一个平台，开心的爬上去，几回训
练之后，老鼠就学聪明了，看见四周的标记，它就能记住平台在那个位置，再被扔进去之后，不用到处找，很快就能摸到平台爬上去。然后过几天，开始测试，卑 鄙的人阿，把平台给撤了。老鼠游阿游阿，心想，谁把俺的平台给撤了！因为老鼠顽强的根据水池四周的标记物认为原来那个地方应该是有台子的，于是尽管没
有，它也会在那个位置停留大多数的时间。以此来记录小鼠根据标志物进行空间记忆学习的能力和记忆的强度。
已经发现有一些小鼠的突变体是对这些任务不能很好的完成的，详见漫谈大牛之Tonegawa篇。


三.圣餐杯 下


第三点就是这篇文章的核心，此文题目为Preferential incorporation of adult-generated
granule cells into spatial memory networks in the dentate gyrus。刚看到这个题目
的时候，吓了一跳，心想，好sexy的标题！如此重大的发现！翻译成中文就是，成年新生成的神经元被"优先"的整合到空间记忆的海马神经元网络中。
第三点要说的是，他们用什么指标来判断，神经元被整合到了空间记忆的海马神经元网络中。


说到这里，c-fos登场了！当当当当！
c-fos是极早期基因，所谓极早期，就是当细胞受到某种刺激，比如说生长激素，电信号等等。极早期基因在几分钟内就会开始启动转录活动，极早期基因都 是一些转录因子，它们被诱导表达后，会迅速激活它们的目标基因表达，所以它们是细胞受到各种刺激后的快速反应部队。


在体外培养神经元里，将神经元去极化刺激后，用northern的方法，10分钟就能检测到一堆mRNA出来，所以转录启动肯定只需要短于10分钟的时 间。c-fos能被快速诱导是Ziff和Greenberg在80年代初做出来的，做出来之后，令人振奋。Jacob和Monod的细菌基因诱导模型带 来了第一个基因表达的诱导模型，让我们认识到基因不仅仅能编码执行代谢功能的蛋白质，还能编码具备调控基因表达能力的蛋白质。c-fos在80年代初的
发现迅速开启了真核基因表达调控的研究热潮。在此之后的10－15年内，c-fos启动子上的所有序列都被折腾清楚了，所有的转录因子也都被搞清了。


从80－90年代Greenberg在他在Harvard的实验室里继续了c-fos的研究工作，因为他们当初发现在体外培养的神经细胞PC12中，刺 激也能诱导c-fos的表达。那么就是说神经的电信号可能会刺激c-fos的表达。在"从mRNA说起"一文中我提到了对学习记忆功能的研 究，Squire在60年代初就发现阻断基因的表达能够影响动物的学习和记忆，c-fos能被神经电信号诱导的事实，显然就使c-fos成为一个在神经 细胞中研究电信号诱导基因表达的模型。研究它，我们就能知道电信号使怎样诱导基因表达的，研究它，我们就能知道阻断电信号诱导基因表达的过程是否能够影 响学习和记忆。然后最终回答Squire的研究提出的问题，基因的表达怎样对学习的记忆产生贡献。事实上也确实是这样，研究发现c-fos被CREB调 控，被CBP调控，被SRF调控，这些蛋白质对学习和记忆的功能都被人们用各种各样的小鼠遗传学模型进行检测。在热火朝天了被研究了15年之后，基本没 人碰c-fos的转录调控模型了，因为都被研究"透了"。我为什么打引号呢？因为我目前的博士后工作发现，c-fos被神经电信号的调控还远未清楚。原 来的简单模型根本不能说明在神经钙信号诱导c-fos基因表达的时候，基因转录被启动的情况。在钙离子进入神经元之后，在c-fos被诱导表达之前的 30分钟之内发生的事情匪疑所思。


越扯越远了，抱歉。这篇文章里，用c-fos作为一个神经元可以对学习记忆活动产生反应的标记。
先让小鼠进行空间学习和测试（就是水迷宫）的任务，之后马上检测小鼠海马区dentate gyrus的c-fos表达，发现一些神经元，请注意，一 些！不是全部，这个一些仅仅是1－2％而已，这1－2％的神经元可以表达c-fos，用免疫组化检测呈阳性。然后，这篇文章就认为，这些表达了c- fos的神经元就是所谓的海马空间记忆网络，spatial memory networks. 看到这，我晕倒了。


没有任何证据证明这1－2％的c-fos 阳性神经元是空间记忆网络，如果要证明这一点，必需将这些能够对学习记忆的活动表达c-fos的神经元特异性 的剔除，或者让它们不能活动，或者让它们不能参与海马的神经活动，然后再看小鼠的学习记忆，受了影响，这才能说，这些能对学习记忆的活动产生反应，表达 c-fos的神经元可能组成了空间记忆网络。


四.抽丝剥茧 上


终于可以说到文章的数据了。我发现我真的非常啰嗦也。
最后再多说一句，刚刚看文章的时候发现，此文章的通讯作者原来是我崇拜的偶像之一Silva的博后，有关Silva见Tonegawa一文。而且这个 paul Frankland在Silva实验室做的非常棒，发表了一篇Nature, 一篇Science，第一次在分子和细胞水平证明了，长期记忆 可能储藏于大脑皮层中。关于长期记忆和短期记忆的讨论，我在Talk to Tim Tully一文中会详细讲解，构思中，敬请期待。


这篇文章所有的重要数据全集中在Figure 1中，而且最重要的数据仅仅是Fig 1h, 就这一个panel，是这篇文章最重要的数据。我们把这个 Figure 1讲清楚了，这篇文章也就理解了。


开始最常规的journal club八股文，Fig 1a, 讲他们怎么做这个学习和记忆的测试，用BrdU标记新生成神经元，然后进行水迷宫测试， 然后牺牲小鼠，进行免疫组化，检测大脑海马区中的神经细胞。为了最后方便比较，他们将标记和最后检测的时间间隔固定，10周，这一固定，就混乱了。我花 了好久才理解这是怎么回事。
比如第一行，我们看到，标记后1周就进行学习走水迷宫，学会了以后，9周后进行测试，测试的结果在Fig 1b, 你可以看到小鼠学会了，仅仅在原来放 平台的地方游来游去，原来放平台的地方成为目标区，target zone,定量分析表明，在目标区停留时间显著高于其他地方，在目标区停留的时间超过 30％，显著高于其他区域，5％左右。然后，他们在分别标记的2，4，6，8周后，进行学习，停留一段时间后进行测试，然后检测。问题就出来了。
我们将第1行和第5行进行比较，第一行是标记1周后学习，等9周后测试，第5行是标记8周后学习，然后等2周，测试。


第一个问题，他们学习与测试之间的间隔不一样，会不会影响最后的结果，比如说刚学了就考试，当然记住的多一些了。他们没有提，但我们比较他们的数据，在 Fig1b里，第1行的定量数据是33％，而第5行的已经升高到41.7%了。看来刚学了就考试确实不容易忘。这一点不影响文章的观点，暂时忽略。


第二个问题，标记1周后，和标记8周后，这些新神经元究竟有多少能够被加入到成年大脑海马的神经元网络大家庭中去。这两种情况下，被加入到成熟神经元网 络中的新神经元一样嘛？
这是他们希望说明的问题，在BrdU标记后，需要至少6周的时间，被标记的神经元才能被整合到成熟的神经元网络中去。


在说明这个问题之前，有一个技术问题需要探讨。这种注射BrdU的方法，究竟对新生成神经元的标记能力有多强，效率多高，有没有副作用？效率问题，通过Fig1f，可以看到他们发现被标记的细胞在一个海马里大概有333个左右。效率多好？我不知道。就当他不错吧。然后有没有副作用？有，肯定有。


一般的培养细胞系，如果你加BrdU进去，BrdU是一个DNA碱基类似物，能看不能用。DNA是被标记了，然后细胞周期马上就停下来了，因为细胞自己检测到外人进来了，DNA被掺入了不该掺入的东西，细胞自己企图修复，肯定是没戏的，被掺了太多没法修，细胞一恼火，老子死给你看！就调亡了。所以培养细胞里，BrdU最直接的作用是可以使细胞调亡。这里再多插一句话，我的博士论文的课题就用到了brdU，我们想看培养细胞在发生分化之前究竟有没有发生细胞分裂，我苦思冥想，没有办法，用brdU?我对导师说，别人都说brdU会使细胞调亡阿，导师说，我们还从来没有在我们的细胞里试过，试试再说，
一试，成了，因为我们的细胞是诱导分化的细胞，最多还只有1－2轮细胞周期，发现brdU的毒性完全可以忍受，细胞就带着毒药分化成了我们的终端目标，
我们证明了没有经过细胞分裂的细胞，就是brdU阴性的细胞，也能完全分化。然后我就开心的毕业了。


回到这篇文章的技术问题上来，注射BrdU究竟对小鼠的学习记忆任务有没有影响？有！
作者很老实，没有隐藏这个数据，只是把这个数据放在了补充数据的最后一个 Supp Fig7，你只能在网上下载下来，然后很耐心的看到最后一个补充数据的时候，才会发现。而且作者还起了一个不相关的名字。


五.抽丝剥茧 中


这个补充数据是标记1周后学习，仅仅隔一天就进行测试，应该是学习最强的了，结果水迷宫数据仅仅为25％！而Fig1a第5行，标记8周后，隔1周进行测试，能达到42％。我们可以想象，如果标记一周后学习，隔一周进行测试，水迷宫数据还会更低！如果把标记1周后学习，隔1周进行测试，和标记8周后学习，隔1周进行测试的数据放在一起，我们完全可以得出另外一个与本文毫不相关的结论，在一周内注射BrdU造成了某种创伤，显著抑制小鼠水迷宫任务的学习。
Fig1a第1行的为什么后来还能达到33%呢？因为学习后小鼠休息了9周才进行测试。大脑自己修复了？


那作者列那最后一个补充数据是想说明什么呢？他们的supp fig7的标题是，一周年龄的新生成神经元不能被加入到空间记忆网络中。
将他们的核心观点放到现在说真是搞笑，他们认为，brdU就可以标记新神经元，注射后一周，这时候你看到的brdU阳性细胞就是一周年龄的神经细胞。在学习水迷宫的时候，大脑的海马会积极开动，将外界的信息转化为神经信号，并储藏起来。这个过程就可以被c-fos标记，因为神经元在历经这个过程后，神经信号会兴奋，会激活c-fos的表达。然后你如果发现这些被BrdU标记的新生成神经元经过学习记忆可以表达c-fos，那么就说明这些新生成的神经元加入到了成熟的神经元网络大家庭中，而且还是分管空间记忆的网络。
然后他们将BrdU标记一周后的老鼠去做学习和测试，最后在海马里中没有检测到BrdU和c-fos都成阳性的细胞，所以刚生成一周的新神经元不能加入空间记忆网络中。


Fig1C,D 给出免疫组化的图片，经过学习后会发现fos阳性的细胞，被标记后会发现BrdU阳性的细胞，那么只有在标记6周后学习才能检测到BrdU和fos都呈阳性的细胞。
Fig1E，在这5种不同的标记情况下，海马DG中检测到的fos阳性细胞是数量不变的，Fig1F，这5种标记情况下，被标记的神经元数量也是基本不变的。
Fig1G,在标记6周后，进行学习和测试，BrdU和fos共阳性的数量最多，Fig1H,在标记6周后学习测试，全体神经元中表达fos的比例为2％，而在新生成神经元中，fos阳性比例超过4％。所以，用brdU标记后6周进行学习任务，大脑海马里新生成的神经元中对学习活动产生反应的比例高于全体神经元（包括成熟的和新的！）中对学习活动产生反应的比例。
所以，新生成的神经元被"优先"的整合到了空间记忆网络中。


现在我们自己来分析一下，我们就拿6周的数据分析，他们指出是最显著的数据。标记6周后学习，等4周后考试，考试完90分钟后检测海马dentate gyrus中BrdU和fos分别和都呈阳性的神经元。
我的第一个问题是，这个水迷宫任务究竟能够诱导多少神经元表达fos？他们把这个数据放在补充数据里，补充数据supp Fig2。经过学习任务后，能够将海马DG区中的fos阳性神经元数目加倍。从Fig1e里的数据，我们看到学习后总共的fos阳性神经元为7670个，他们没说，我拿尺子量出来的。好，那海马的DG区总共有多少神经元呢？从Fig1h，我们看到fos阳性神经元占总数的2％，反算一把，我们知道他们统计的神经元总数是
~380000个。他们的核心观点是学习后，新生成的神经元优先进入神经元网络，唉，我还是用大白话来说，小鼠在经过学习任务后，新生成的神经元优先对学习记忆的活动发生反应，表现为表达c-fos。我们先不说这表达c-fos是否能够代表神经元发出了某种反应，以及没表达的是不是就没发生反应。
我们单单看一看，他们能否说明他们自己的观点。


六.抽丝剥茧 下


从fig1f我们知道，标记后6周，在海马DG区可以留下大概333个被标记的神经元，他们应该是标记以及之后才发生细胞分裂而产生的新神经细胞。那么标记6周后，经过学习，他们中多少能够对学习诱导的神经活性发生反应呢？从Fig1h中，我们可以看到是4－5％，算16个。
好，就是说经过学习，在小鼠海马DG区的总共380000个神经元中，有7670个神经元能对学习活动发生反应而表达fos，而在学习任务之前的6周之内新产生的333个神经元中，有16个可以对学习活动发生反应而表达fos.16/333＝5％>>7670/380000＝2％.所以，新产生的神经元可以优先的加入到成熟神经元网络中去。
（值得指出的是，所以BrdU阳性的神经元10周后也会表达成熟神经元标记NeuN，而被记入成熟神经元。见补充图5。）
他们能否自圆其说呢？
在fig1h中，他们画了一条上升的曲线，代表标记后的不同时间进行学习，如果间隔太短，新神经元来不及成熟，所以就不能在学习的时候对神经活性产生反应表达fos。所以这条曲线当然是上升的，但并不能说明新细胞就优先的产生反应的道理。fig1h的另外一条线是fos阳性细胞占总数的比例，不变，不管你在什么时候加brdU标记，学习后海马DG区的fos反应不受明显改变。由于他们的样本量非常大，38万个，所以这条线几乎没有标准差，好看的很。
不幸的是，上升的曲线error bar实在是不小。样本量300多，凑合了，说明fos+BrdU双阳性细胞的数据浮动还是很大的，不奇怪，最显著的才16个，多一个少一个，这差异就上去了。
我个人，不认为，能通过16/333>7670/380000来说明这么一个重要的观点，新的神经元就优先的产生反应。这16个能对学习产生反应的新神经元，仅仅占能对学习产生反应的神经元总数7670的0.2%，差了三个数量级。


下面简单的说一下这篇文章的几个图，图2，做了另外一个极早期基因Arc，也是用差三个数量级的数据进行比较。图3，这个学习不会刺激嗅球中增强fos表达，当然了，老鼠不靠鼻子来判断水下的平台在那里。图4，太年轻，一周的新神经元不会被学习活动诱导fos，哼，BrdU的副作用我还没问你呢。图5，又把实验无聊的重复了一边，学习后在加brdU标记的话，标记的新神经元也没有反应，这到还有点意思，说明是学习的时候大脑活动诱导的活性刺激新神经元表达fos。
图6，final!又，为什么要说又呢，又起了一个特别sexy的名字，可惜这个图说的观点跟本文核心观点一点关系没有。他们用一个CaMKII的突变，这个突变以前就是本文通讯作者的博后老板最早发现的。这个突变小鼠学习记忆受损，他们发现这个小鼠记不住水下的平台在什么地方，海马中的表达fos的神经元也大大下降，不奇怪，一个这个CaMKII是神经活性刺激神经元细胞内部活动的重要开关，如果它坏了，当然神经元就不能对正常的生理过程产生反应了。作者们无聊的证明这个突变小鼠的新神经元产生过程并不受影响，然后因为总共的fos阳性细胞少了，当然新神经元中能对学习活动产生反应的fos细胞也就少了。我实在不能认为这跟证明这篇文章的主题有什么关系。


七.踏上征途


光argue不算本事，人说了，不管怎么说，我做出来了，你说这样做不行，那你说怎么办？
怎么办呢？不好办，用这种BrdU标记的方法标记的333个新神经元在经过学习记忆任务后，撑死也就才16个能表达fos。效率太低！是因为新神经元本身就很难成熟嘛？不是，这篇文章也提到BrdU标记的新神经元最后超过90％都能变成成熟的神经元可以被NeuN标记。那么就是说这个水迷宫的学习任务本身就不能在海马的dentate gyrus内激活很强的神经活性反应。在随着作者的思路，企图确定学习活动后，新的神经元和老的神经元，那个更容易发生反应（"加入空间记忆网络"中去） 之前。让我们回到问题的本源。
说到这，我有一个听上去特土的问题，如果能对学习产生反应的新神经元真是他们记录到的16个，那么这16个新神经元相对于整个海马DG区能对学习产生反应的7670个神经元，简直是沧海一粟。这16个新兵对大部队有啥影响？如果没有什么大影响，那我们折腾他们干什么？
在没有确定新生成的神经元对学习和记忆过程有什么影响之前，研究学习活动可以怎样促进新神经元
整合到成熟网络中去是一个非常奇怪的问题，当然我们需要文章，研究生需要毕业，博后需要找工作，我们可以装傻，新神经元产生当然是有重要功能的了，很可能是对学习和记忆有贡献的，你敢说圣餐杯不存在嘛？
但是，如果新生成的神经元对学习和记忆，不说远的，就是如果对他们用的水迷宫检测的空间记忆没什么贡献，这个研究本身就会扔到废纸堆里去。这种可能性是50％，不会因为你长得帅而变成51%。


让我们踏上征途，看看究竟怎样来研究新神经元在成年大脑海马里的生成对学习和记忆和其他高级认知活动有没有影响。


去年4月份的时候，老蒲的得意门生之一，Song Hongjun来访问，给了一个报告，讲他们一个非常漂亮的工作。他们人为的干扰这些新生成神经元的成熟过程，发现影响发育中的一个开关后，让神经过早成熟，结果这些早熟的新神经元不能真正的成熟而加入到成熟的神经网络中去，这里他们全是用的非常PP的电生理手段来检测神经元是否成熟，是否能够接受其他神经元的刺激，等等，比只看fos的水平令人信服多了。他给完talk之后，我就问了一个问题，能否用这个方法来研究神经干细胞在动物高级认知功能的作用？他说Fred Gage已经开始做了。


因为成年体内的新神经元生成的功能研究中一个非常重要的考虑是不能干扰正常的成熟神经元生理功能。Hongjun的研究提供了一个手段，抑制一个基因的表达NKCC1，可以使新神经元早熟而失去正常的生理功能。这个成熟过程，每一个神经元都会经过，在成体大脑内，在成熟神经元内再抑制NKCC1，应该不会有任何作用了，那么就会仅仅针对于新产生的神经元。等下，对于成熟神经元中抑制NKCC1究竟是不是按推理没有明显的影响我并不知道有没有数据支持，仅仅推理而已。
那我们就让NKCC1特异性的在成年小鼠的大脑海马区中消失！
这个时候，成熟的神经元都没事，而新产生的神经元由于失去了这个基因，会很快早熟，而不能执行正常的生理功能。然后再对小鼠，就可以想干什么干什么了，看看对学习，短期记忆，长期记忆，blah, blah, blah.
这个东西已经不是梦想了，现在的技术手段完全可以实现，本着老蒲 Ideas are cheap！的原则，我把技术上怎么实现说一下，各位谁有兴趣回去做出来，发了CNS，找到了工作，或者Nobel炸药奖，别把我忘了，虽然俺只出了主意，没啥大credit，如果Nobel lecture能提我一句，我这篇又臭又长的文章也算没白写。
首先用loxp flox NKCC1的基因，构建一个gene targeting mouse line.
第二个转基因line，或者knock in line, 设计让Cre-ER在海马DG区特异性启动子驱动下表达，现在已经有的CaMKII，synapsinI启动子都能用，不太好，prox1是海马DG区特异标记，如果能找到这种基因，做个转基因或knock in，就perfect了！基因如果是单exon的，像odorant receptor那样，内源基因都不用破坏，接一个IRES－Cre-ER就行了。
小鼠长大之后，加tamoxifen诱导Cre-ER作用，在海马DG区特异性的剔除NKCC1基因，all set!


好了，我该打住了，如果有人能有耐心看到这里，我实在是非常敬佩，对于你可以忍耐这又臭又长的文章那么久，敝人非常感激。今天国内正月十五，祝各位人圆月圆，合合满满。